ELISA

什么是ELISA？

ELISA是酶联免疫吸附测定法（ELISA）的缩写。ELISA在科研、医疗保健和食品健康环境中常用于测量目标分析物（如激素、抗体和蛋白质生物标记物等）。在ELISA中，分析物是抗原，即抗体的靶标。抗原通常被吸附（附着）在96孔板上，并被免疫球蛋白（抗体）特异性识别，免疫球蛋白（抗体）上带有用于检测的酶。ELISA测定有多种变化形式，但基本要求不变：

• 固相：提供一种将溶液中的结合伙伴与未结合分子分离的方法。通过吸收或附着在塑料96孔板上实现。
• 抗原：抗体的结合伴侣或靶点。通常为固相分子。
• 抗体：至少一种对抗原进行特异性识别的多克隆或单克隆免疫球蛋白。
• 检测：通过某种信号手段量化结合与未结合的抗原或抗体。可选方法包括比色技术、荧光技术或发光技术等。

这些基本要素可以组合成多种形式，包括直接酶联免疫吸附试验、夹心酶联免疫吸附试验和捕获酶联免疫吸附试验。它们之间的区别在于固定哪种成分、如何识别以及检测什么。通过5种基本形式的组合可以创造出更为复杂的分析测定，但简单起见，以下仅列出最基本的测定形式。

多种ELISA测定形式

直接ELISA	优点	缺点	步骤	试剂
	简单易操作	要求： 高特异性抗体，单抗原样品	1. 固相	抗原
			2. 识别和检测	标记一抗

间接ELISA	优点	缺点	步骤	试剂
	灵敏度高，模块化	要求： 多步骤操作，单抗原样品	1. 固相	抗原
			2. 识别	一抗
			3. 检测	标记二抗

直接ELISA的形式最为简单，只需要将抗原吸附在孔板上再与标记“检测”抗体结合即可。“直接”是指第一个也是唯一一个抗体既是抗原识别分子，又是信号传递分子。这与 "间接ELISA不同，后者将检测和信号传递任务分给了"一抗"和"二抗"。间接ELISA使用未标记的抗体来检测孔板中的抗原，然后通过具有信号传递作用的第二抗体（二抗）来检测第一抗体（一抗）。直接ELISA的突出优势在于简单快捷，而间接ELISA虽然在抗原结合与信号检测之间增加了操作步骤，但依然有着其自身的优点。间接ELISA利用二抗传递信号，可以使用模块化二抗识别一抗的恒定（Fc）区。因此，标记的二抗可用于多种不同的ELISA，而一抗无需修改。一抗通常是单克隆抗体，是一种珍贵且价格高昂的资源，而二抗则通常是多克隆抗体，生产成本低廉而且生产速度快。除了成本之外，这种单克隆一抗与多克隆二抗的组合还能通过信号放大来提升性能。由于多克隆抗体中含有多种不同的克隆，每种克隆只能识别自己的抗原表位，因此多克隆抗体可以结合一抗Fc恒定区上的多个位点。在上述示例中，多个标记多克隆二抗会修饰蓝色一抗。直接ELISA的检测受限于分析测定中唯一抗体的标记程度。在间接ELISA中，一抗能被2到3种多克隆二抗识别，因此每种一抗信号量会增加2到3倍。直接和间接ELISA测定法都可以扩展成为以下讨论的所有变化形式。

夹心ELISA	优点	缺点	步骤	试剂
	灵敏，在复合样品中的表现出色，可揭示表位	多步骤操作，要求抗体配对	1. 固相	捕获抗体
			2. 捕获靶点	抗原
			3. 识别和检测	标记检测抗体

夹心ELISA的区分特征在于将“捕获”抗体吸附在孔板上。抗原与平板上的抗体结合或被其捕获，然后"夹"在捕获抗体和检测抗体之间，检测抗体能识别抗原上截然不同的表位。夹心ELISA的主要优势在于能够特异性地检测不纯样品中的抗原。捕获抗体不会将粗样品吸附到平板上，而是提供检测特异性和去污能力。夹心ELISA当中同样能够收获间接检测的机会。检测抗体不会携带信号，而是由第三种抗体作为靶点，为分析测定提供信号。

捕获ELISA	优点	缺点	步骤	试剂
	揭示抗原表位，消除孔板-抗原的相互作用，不要求抗体配对	多步骤操作，要求生物素化	1. 亲和素固相	亲和素
			2. 捕获靶点	生物素化靶点
			3. 识别和检测	标记检测抗体

“捕获”ELISA是一种与夹心ELISA相似的技术，使用亲和素-生物素复合物将抗原保留在孔板上。吸附到ELISA孔板时需要一定程度的疏水性相互作用和电荷相互作用，这可能对抗原的结构造成负面影响，从而抑制抗体识别。通过吸附大型四聚体蛋白亲和素，可以对生物素标记抗原进行固相，同时避免造成孔板-抗原相互作用。此外，生物素-亲和素捕获可以将抗原与孔板隔开。增加抗原与孔板之间的距离有助于实现对抗原的三维通路建立，而直接涂镀则可在空间上掩盖抗原表位的通路。生物素捕获法还是一种可从复杂样品中回收生物素化抗原的有利技术。

竞争性ELISA	优点	缺点	步骤	试剂
	量化复杂样品中的抗原	多步骤操作，要求使用标准曲线	1. 固相	抗原
			2. 抗体上的竞争抗原识别位点	抗原和标记检测抗体
			3. 识别和检测	标记检测抗体

最后一种可能采用的ELISA类别是“竞争性”ELISA。这种酶联分析测定与直接ELISA相似，抗原可直接吸附到孔板上。但检测抗体在涂覆于孔板之前还需要使用抗原数量未知的样品进行预培养。抗原数量较多的样品将占据一抗的结合位点，进而阻止一抗与孔板抗原结合。相反，抗原数量较少的样品将有更多的抗体可用于结合孔板抗原，从而产生更高的信号。在竞争性ELISA中，返回的信号与样品中抗原-抗体相互作用的集中程度密切相关。因此需要在同一套孔板上滴定数量已知的抗原来建立标准曲线，以便量化未知样品中的可用抗原。竞争法酶联分析测定可以与捕获法及夹心法合并使用。也可采用间接检测。

如何优化ELISA

ELISA是目前除蛋白质印迹之外最常用也最为灵敏的分子生物学工具之一。ELISA经过妥善优化后，其检测限正常可精准到抗原的毫微微克量级。与蛋白质印迹法不同，ELISA通过将实验样本与在匹配的缓冲液成分（例如，如果实验样本为血清，则包括血清）中滴定已知量样本而形成的标准曲线进行比较，从而提供高度可量化的数据。除了选择合适的分析测定形式外，ELISA许多步骤中的每一步都是优化的机会。可能需要对以下部分或全部环节开展经验检验，以获得信噪比最大化：

• 孔板：孔板化学构成的变化可能导致抗原吸附效率的差异化和非特异性结合，从而影响到信噪比。ELISA孔板的几何形状也会影响到孔板效率和最终的信号强度。应并排比较不同的板化学成分和几何形状，以确定ELISA的最佳做法。如果怀疑孔板化学构成限制了ELISA的性能，则采用捕获ELISA进行检验可能较为实用，因为这种测定形式会杜绝可能存在的表位掩蔽或构象变化。
• 缓冲液：在可能的情况下，保持最佳温度、pH值和盐浓度对于实现最佳性能至关重要。此处不仅针对于结合缓冲液，还延伸到包被缓冲液和清洗缓冲液。虽然温度越高，培养时间越短，但温度的升高也会增加非特异性结合。有鉴于此，最为合适的做法应为夜间孔板维持室温，封闭期间维持37摄氏度，结合时再恢复至室温。另外，保持所有其他条件不变，对各种不同的温度、pH值、盐、无关的蛋白质封闭等进行检验可确定最佳条件。
• 抗体亲和力：ELISA的性能高度依赖于抗体亲和力。在浓度匹配的情况下，不同的克隆将表现出优于其他克隆的性能。除了创造或寻找替代抗体外，亲和力问题并不容易解决，但滴定浓度可以优化抗体的使用量，在合理的范围内，甚至可以适应低亲和力的抗体。阴性对照相当关键，因为抗体浓度的增加同时也会增加非特异性结合的风险。
• 抗体克隆性：使用单克隆或多克隆抗体作为检测物种将影响到酶联测定的灵敏度。对于ELISA中的抗体克隆性能能力，目前有两种竞争性的理论。虽然单克隆抗体具有特异性，但由于表位识别能力有限，通常信号较低。多克隆抗体可以识别每个抗原上更多的表位，但即使是亲和性纯化的多克隆抗体，也会固有地带来不必要的潜在交叉反应。以夹心ELISA为例，单克隆捕获抗体只能从样品中回收特定的靶点，而多克隆捕获抗体则会回收最大量的靶点，但同时也会伴随一定的非特异性结合。以上任意一种抗体在其克隆形成能力的协助下可用作检检验剂，但都要关注同样的特异性注意事项。样品质量无疑会影响到ELISA的性能。复杂样品可在很大程度上受益于单克隆抗体捕获的特异性优势，而成分简单但靶点浓度较低的样品则可受益于多克隆抗体捕获。不过仍应强调，经验检验可揭示最理想的克隆使用或者组合使用。
• 信号：酶促信号显现可提供可靠的检测，但应注意在淬灭反应前优化显现时间、温度和体积。时间太短或温度太低都有可能减弱信号生成，而时间太长或温度太高则可能导致噪声增多。体积通常受限于孔的大小，但一旦优化，也应在整个检验和研究期间保持恒定。如果能够检测到充足的信号，则荧光报告基因同样可以用于同时测量多种目标物，而其中检测抗体的荧光标记则有助于简化测定方案。

ELISA的应用

除了以上所列应用外，ELISA技术甚至应用到了普通非处方类诊断当中，例如家庭孕检。这些类型的检验又称为“试纸条”ELISA测定，其中利用了侧向流动和夹心ELISA原理。先在毛细管作用下抽样，样品通过含有未结合检测抗体的区域，再通过含有固相捕获抗体（同样特异于被分析物）的区域。虽然这种简化版的ELISA不能提供可量化的结果，但它速度快、成本低，非常适合在护理点和家庭检测环境中使用。

ELISA相关服务

无论是生成ELISA的定制抗体，还是在公司内部生产ELISA试剂盒，GenScript都能随时为您提供帮助。我们的定制化单抗服务是洁净透明的直接ELISA的理想选择，而 PolyExpress™服务则是生成针对目标物的检测抗体的完美选择。我们的抗体标记服务能够无缝整合到任意项目当中，让的ELISA定制创建变得更简单。我们甚至可以为定制夹心ELISA生成优化配对抗体。其他一些相关服务还包括：

• Anti-Idiotype Antibodies能够让治疗性抗体药物的PK或PD检验变得更加简单，因为这些抗体只检测靶抗体中的CDR。
• mRNA免疫策略是我们的专长。可避免体外蛋白质抗原的生产，并可处理困难的靶点。
• 高通量TurboCHO™表达平台可在快至14个自然日实现g级表达重组抗体用于快速筛查

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