FAQ：引物的合成和纯化

1. 引物是如何合成的？

目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。该方法具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。主要是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成，由待合成引物的3'端向5'端合成延伸，相邻的核苷酸通过3'→5'磷酸二酯键连接。

固相亚磷酰胺三酯法合成引物的具体步骤如下：

• 用三氯乙酸去除固相载体5'-羟基的保护基团DMT，获得游离的5'-羟基；
• 将亚磷酰胺保护核苷酸单体与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，与游离的5'-羟基发生缩合反应；
• 由于无法保证百分之百的5'-羟基都参与缩合，可能有极少数5'-羟基没有参加反应（少于2%），可用乙酸酐和1-甲基咪唑试剂将其终止合成，这种短片段可以在纯化时分离掉；
• 在氧化剂的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯，使DNA磷酸骨架更稳定。

经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸就被连接到固相载体上。重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基连接完成。合成过程中可以监控脱下的保护基团DMT的颜色可以初步判定合成效率。

2. DNA合成粗产物中含有什么杂质？

主要是合成过程中产生的少量失败片段。

3. 引物纯化方式有哪些？

目前引物常用的纯化方式有：C18脱盐、RPC纯化、ePAGE纯化、PAGE纯化、HPLC纯化。

表1. 引物纯化主要方式的介绍

4. 引物纯化方式如何选择？

金斯瑞采用RPC、ePAGE纯化、PAGE、HPLC四种纯化方式，在选择上主要根据引物的长度和应用方面对纯度的要求而定，表2即从引物长度的角度总结了以上每一种纯化方法的适用范围。您可根据实验需要，选择合适的引物纯化方式。如您需要进一步的指导，请联系金斯瑞技术支持。

表2. 引物纯化主要方式的适用范围及建议

注：*为了保证您的引物纯度，对于<5mer的短链引物选择RPC纯化前请先致电咨询

5. 合成的引物5'端是否有磷酸化？

合成的引物5'端为羟基，没有磷酸基团。如果需要，您可以用多核苷酸激酶进行5'端磷酸化，或者要求我们合成时直接在5'或3'端进行磷酸化，需要另外收费。

6. 最长可以合成多长的引物？

引物越长，出现问题的概率就越大。除非有特殊需要，我们建议合成片段长度不要超过80mer，按照目前的引物合成效率，80mer的粗产品，全长引物的百分比不会超过40%，后续处理还会丢失很多，因此最后的产量很低。金斯瑞可合成长达150base的引物。

7. 为何长链引物的收费要比短链引物要高？

在合成长链引物时，所需要的试剂比短链引物要多，回收值也相对低一些，尤其是长度大于90base的引物。由于成本的增加，从而导致价格升高。

8. 交付引物质量好坏的判断标准是什么？

合成的引物和您的订单序列一致，通过完善的订单订购系统，全自动序列导入系统以及严格的质量控制体系，确保合成序列准确无误。

9. PCR产物经过克隆以后测序发现引物区与合成序列不相符合，怎么办？

多数情况是PCR过程和克隆过程中引入的错误。遇到这种情况，请您

• 重新挑取克隆测序，会有找到正确克隆的可能。
• 可以要求我们重新免费合成引物。

10. 测序发现引物有突变是怎么回事？

引物合成是一种多步骤的化学反应，每一步的合成效率最高也就是99%，副产品不可以避免。链越长，突变的频率累加起来就越高。在您PCR扩增后克隆测序的时候，为了节约时间和提高成功率，我们有如下建议：

• 请您在检测到阳性克隆后准备2~3个阳性克隆子的菌液，尽量送测2个或以上克隆，这样成功率将大大提高，也节约很多时间；
• 也可以先送测1个克隆，其余两个克隆子的菌液在冰箱4度保存，一旦出现个别点突变或缺失，立即将余下的两个克隆送测；
• 这样得到正确的序列可能性将非常高，并且可以免去重新PCR、连接、克隆以及筛选的一系列实验操作，更省去了很多时间；

如您发现2~3个以上克隆都在引物区存在突变，经确认是由引物的原因引起的话，我们将会立即安排加急免费重合，并以足够快的速度送到您的手里。

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